O jogo começa imediatamente após os eventos de Assassin's Creed. Desmond Miles e uma aspirante a assassina, Lucy Stillman, escapam do laboratório de Abstergo, seguindo para um esconderijo dos assassinos. Desmond descobre que os assassinos, com poucos recursos e dinheiro, estão tendo dificuldades para vencer os templários. Lucy revela que uma equipe dos assassinos, formada por ela e os experientes em tecnologia Rebecca Crane e Shaun Hastings têm trabalhado em um novo dispositivo baseado no modelo original de Animus usado pela Abstergo, o Animus 2.0. Desmond, então, vê as memórias de um novo assassino através da nova máquina.

Ezio então parte junto com sua mãe e sua irmã para a vila dos Auditore em Monteriggioni, onde descobre que o seu pai era secretamente um assassino. Ezio passa a ajudar o seu tio Mario na guerra entre os templários e os assassinos, com o intuito de se vingar dos causadores da morte de sua família.




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